실험 방법론: 산화 스트레스 ↔ Nrf2 ↔ Ferroptosis ↔ Mitophagy

📄 Zhang et al. (2026), Redox Report, doi: 10.1080/13510002.2026.2654906 신경퇴행성 질환에서 산화 스트레스-Nrf2-Ferroptosis-Mitophagy 연결 고리 검증을 위한 실험 방법론 총정리

🐭 1. KO Mouse Models

**Nrf2⁻/⁻ (Global KO)** • 배경: C57BL/6J • 제조사: Itoh K. et al. 1997 (Riken RBRC) • 적용: 산화 스트레스 취약성 ↑, ferroptosis 감수성 증가, dopaminergic neuron 손실

**Keap1 Knockdown (Keap1-KD)** • Keap1 발현 약 10~15%로 감소 → Nrf2 지속 활성화 • 적용: Nrf2 과활성화 모델, ferroptosis 저항성 증가

**GPX4 Conditional KO (NEX-Cre)** • 뇌 특이적 GPX4 제거 → LPO 축적 → neuronal ferroptosis • 적용: Ferroptosis의 GPX4 의존성 직접 증명

**PINK1⁻/⁻ & Parkin⁻/⁻** • PINK1: mitochondrial membrane potential 감지 • Parkin: E3 ubiquitin ligase → mitophagy 실행 • 적용: PINK1/Parkin mitophagy 경로 필수성 증명

**SIRT3 cKO (NEX-Cre)** • 뉴런 특이적 SIRT3 제거 → mitochondrial oxidative stress ↑ • 적용: SIRT3 → PINK1/Parkin 연결 고리 증명

**SLC7A11 (xCT) KO** • Cystine uptake 차단 → GSH 고갈 → ferroptosis • 적용: Nrf2-SLC7A11-GPX4 축 검증

🧫 2. Cell Models

**MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts)** • Nrf2⁻/⁻ vs WT 비교 | erastin·RSL3 처리 • 장점: 유전자 조작 용이, 빠른 실험 속도

**HT22 (Hippocampal Neuronal Cell Line)** • Glutamate-induced oxidative stress 모델 • GPX4 KD → ferroptosis | Nrf2 KO → 감수성 증가

**SH-SY5Y (Human Neuroblastoma)** • RA 분화 → dopaminergic neuron-like • PINK1/Parkin KD → mitophagy 결핍, CCCP 처리로 유도

**Primary Neurons** • E16-18 cortical / E17 hippocampal (C57BL/6) • DIV7-14 성숙, Nrf2 KO 마우스 유래 비교 가능 • 장점: 가장 생리적, 단점: 수율 낮음

**ρ⁰ Cells (Mitochondrial DNA 결핍)** • EtBr 처리로 mtDNA 제거 → mROS 없음 • 적용: ferroptosis에서 mitochondria 역할 규명

💊 3. 약물 도구 (Pharmacological Tools)

**🔴 Nrf2 Activators** • Sulforaphane (SFN): Keap1 Cys151 modification → Nrf2 핵 이동 • tBHQ: Keap1 산화 → Nrf2 안정화 • CDDO-Me (Bardoxolone): 가장 강력한 Nrf2 activator, 임상 사용 • DMF (Dimethyl fumarate): MS 치료제, Nrf2 경로 활성화

**🔵 Nrf2 Inhibitors** • ML385: Nrf2 DNA-binding domain 직접 차단 • Brusatol: Nrf2 단백질 분해 촉진 (비특이적) • Trigonelline: Nrf2 핵 이동 억제

**🔴 Ferroptosis Inducers** • Erastin: SLC7A11 차단 → cystine 고갈 → GSH↓ → GPX4 불활성화 • RSL3: GPX4 직접 억제 (covalent binding) • FIN56: GPX4 분해 + CoQ10 고갈 • FINO2: Lipid peroxide 직접 생성

**🔵 Ferroptosis Inhibitors** • Ferrostatin-1 (Fer-1): Lipid radical 연쇄 반응 차단 (가장 널리 사용) • Liproxstatin-1 (Lip-1): in vivo 안정성 우수 • Deferoxamine (DFO): Fe³⁺ chelation → Fenton 반응 차단 • NAC: GSH 전구체 공급 → GSH 재합성

**♻️ Mitophagy Modulators** • CCCP: Mitochondrial uncoupler → ΔΨm 소실 → PINK1 안정화 (gold standard) • Antimycin A: Complex III 억제 → mROS + ΔΨm 소실 (더 생리적) • Mdivi-1: Drp1 억제 → mitochondrial fission 차단 • Chloroquine: Autophagosome-lysosome fusion 억제 (flux 측정용) • 3-MA: PI3K class III 억제 → autophagy initiation 차단

🧬 4. Omics Technologies

**RNA-seq** Nrf2-KO vs WT ± erastin → DEG → GSEA → ferroptosis gene sets 주요 결과: GPX4, SLC7A11, SLC3A2, FTH1, NQO1, HO-1, GCLM/GCLC 확인

**ChIP-seq** anti-Nrf2 antibody + SFN/tBHQ → ARE motif 검색 주요 결과: GPX4, SLC7A11, NQO1, HMOX1 promoter에 Nrf2 직접 결합 확인

**Lipidomics (LC-MS/MS)** oxPEs, oxPCs 정량 | GPX4 KO vs WT 비교 주요 결과: PUFA-PE 산화 생성물 동정, Nrf2→GPX4→oxPLs 제거 회로 증명

**Single-nucleus RNA-seq** 14 cortical regions, 1,121,772 nuclei | Cell type-specific transcriptome 주요 결과: Glutamatergic 9 subtypes, GABAergic 7 subtypes 분류

**Spatial Transcriptomics (Stereo-seq)** PD substantia nigra 산화 스트레스 map | 1,888,306 cells 주요 결과: NOX4, GPX4 (DA neurons) ↔ 염증 유전자 (astrocytes) spatial colocalization

**UPLC-MS/MS (Biomarker Panel)** 8-OHdG (DNA), 8-OHG (RNA), 4-HNE (lipid), dityrosine (protein) 동시 정량 적용: 개인별 산화 수준 평가 → Personalized antioxidant therapy

📊 5. 연결 고리별 실험 방법 요약

**OS → Nrf2** KO: Nrf2⁻/⁻, Keap1-KD | Cell: MEFs, primary neurons, HT22 약물: SFN, tBHQ, CDDO-Me, ML385 | Omics: ChIP-seq (ARE), RNA-seq

**Nrf2 → Ferroptosis** KO: GPX4-KO, SLC7A11-KO | Cell: Nrf2-KO MEFs, HT22, SH-SY5Y 약물: Erastin, RSL3, FIN56, Fer-1, Lip-1 | Omics: RNA-seq, Lipidomics

**Ferroptosis → Mitophagy** KO: PINK1⁻/⁻, Parkin⁻/⁻, SIRT3-cKO | Cell: SH-SY5Y, primary neurons, ρ⁰ 약물: Antimycin A, CCCP, Oligomycin, Mdivi-1 | Omics: Proteomics, Spatial transcriptomics

**SIRT3 → PINK1/Parkin** KO: SIRT3 cKO (NEX-Cre) | Cell: Primary neurons 약물: MitoQ, SkQR1 | Omics: Acetyl-proteomics, Metabolomics

📚 Key Original Papers

• Keap1-Nrf2 발견: Itoh K, et al. Genes Dev. 1999; 13(1):76-86 • Ferroptosis 발견: Dixon SJ, et al. Cell. 2012; 149(5):1060-1072 • PINK1/Parkin mitophagy: Narendra D, et al. J Cell Biol. 2008; 183(5):795-803 • Nrf2-GPX4 axis: Dodson M, et al. Trends Biochem Sci. 2019; 44(5):375-390 • Nrf2-SLC7A11: Sun X, et al. Cell. 2016; 49(4):1813-1824 • GPX4 conditional KO: Seiler A, et al. Cell Metab. 2008; 8(3):237-248 • SIRT3 & mitophagy: Liu J, et al. Phytomedicine. 2024; 125:155358